Fizyka jest nieodłącznym partnerem medycyny już od XIX wieku. Jednak za prawdziwy początek nowoczesnej fizyki i inżynierii biomedycznej uważa się końcowe lata XIX wieku – rok 1895 – odkrycie promieniowania X przez Konrada Wilhelma Roentgena (ur. 27 marca 1845 w Lennep, zm. 10 lutego 1923 w Monachium – laureat pierwszej Nagrody Nobla w dziedzinie fizyki 1901 rok) oraz rok 1898 kiedy to Maria Skłodowska Curie (ur. 7 listopada 1867 w Warszawie, zm. 4 lipca 1934 w Passy – dwukrotna laureatka Nagrody Nobla 1903 i 1911) i Piotr Curie (ur. 15 maja 1859 w Paryżu, zm. 19 kwietnia 1906 – laureat Nagrody Nobla 1903) odkryli pierwiastki promieniotwórcze.
Obecnie nikt sobie nie wyobraża nowoczesnej medycyny bez aparatury naukowej, która z czasem stała się standardową aparaturą medyczną. Przykładem może być chociażby aparatura wykorzystująca odkryty w roku 1938 przez Isidora Rabi (ur. 29 lipca 1898 w Rymanowie koło Krosna, zm. 11 stycznia 1988 w Nowym Jorku – laureat Nagrody Nobla z fizyki w 1944 roku)) jądrowy rezonans magnetyczny (NMR). Urządzenia tego typu są wykorzystywane w analityce i laboratoriach naukowych do badania cieczy i ciał stałych. Po raz pierwszy zostały wprowadzone na rynek medyczny w roku 1972 i od tego czasu większość szpitali posiada dostęp do aparatury MRI (Magnetik Resonans Imaging) w Polsce pierwszy MRI stanął w roku 1991.
Kolejnym przykładem aparatury naukowej stworzonej do zupełnie innego celu niż medycyna, a wykorzystująca zjawiska fizyczne jest ultra sonograf (USG). Początkowo urządzenia te miały być używane do wykrywania wad w metalach, a komercyjnie do szpitali zostały wprowadzone dopiero w larach 60 i 70 XX wieku.
Takich przykładów można by podać jeszcze wiele, ale w tym artykule chcę się skupić na mikrobiologii, która również korzysta z dobrodziejstw fizyki. Bezpośrednio np.: mikroskop optyczny, który pozwala na potwierdzenie obecności bakterii w pobranym materiale oraz na obserwacje morfologii komórek bakterii. Pośrednio natomiast poprzez automatyczne aparaty do identyfikacji, w których nie obserwujemy bezpośrednio komórek bakteryjnych, a biochemiczne efekty ich działania (za pomocą metod fizycznych obserwujemy zmiany w roztworze, w którym zostały zawieszone bakterie).
Metody te są znane od wielu lat i tak jak w innych dziedzinach medycyny obserwowaliśmy ciągłe nowe połączenia z fizyką, tak w mikrobiologii nic się nie zmieniało aż do roku 2010. W tym roku do laboratoriów mikrobiologicznych „wkroczyła” fizyka w pełnej okazałości ze spektrometrem mas. Służy on di identyfikacji mikroorganizmów, wykorzystując technologię MALDI (ang. matrix-assisted laser desorption/ionisation — desorpcja/jonizacja laserowa z użyciem matrycy) oraz TOF (ang. Time-Of-Flight — czas przelotu). Metoda ta pozwala na szybką i dokładną identyfikację drobnoustrojów (bakterii, grzybów drożdżopodobnych, grzybów strzępkowych) na podstawie białek rybosomalnych występujących w dużej ilości w komórkach mikroorganizmów. Ale jak dokładnie przebiega analiza? Z punktu widzenia użytkownika systemu: musi on jedynie pobrać niewielką ilość materiału do analizy zawierającą 105 komórek bakteryjnych (pojedyncza kolonia), nakropić 1µl matrycy umieścić płytkę w spektrometrze i czekać ok. 7 min na wynik identyfikacji (dla pojedynczej próbki, ok. 1,5 godziny dla 95 próbek).
Z punktu widzenia fizyka bardziej interesujące są procesy zachodzące po włożeniu płytki do spektrometru. Urządzenie laserowe znajdujące się wewnątrz spektrometru napromieniowuje wysuszony punkt matrycy skupionym intensywnym impulsem światła UV. Zadaniem matrycy jest absorbcja promienia w zakresie UV oraz przekazanie ładunku (protonu) w celu jonizacji badanej substancji. Powstałe jony są przyśpieszane w polu elektrostatycznym na krótkim dystansie i trafiają do przewodu przelotowego z prędkością uzależnioną od ich masy. Ponieważ poszczególne białka/peptydy mają odmienną masę, jony docierają do detektora w różnym czasie (czas przelotu). Spektrometr mas mierzy czas od impulsu akceleracyjnego do momentu uzyskania sygnału z detektora, a prędkość przelotu jest przeliczana na masę cząsteczkową. Dzięki temu procesowi uzyskiwane jest widmo mas z charakterystycznym wzorcem rozkładu mas i natężenia dla danego mikroorganizmu, widmo to jest nazywane ono jest „molekularnym odciskiem palca” mikroorganizmu. Widmo to jest porównywane z biblioteką widm znanych mikroorganizmów. Obecnie na rynku największą bazę mikroorganizmów posiada system MALDI Biotyper firmy Bruker w której możemy znaleźć widma ponad 2380 gatunków mikroorganizmów (bakterii i grzybów drożdżopodobnych), a dodatkowo Bruker oferuje także bibliotekę grzybów strzępkowych zawierających 110 gatunków oraz bibliotekę mykobakterii zawierających 159 gatunków ze 169 obecnie znanych.
Kolejnym problemem medycznym i mikrobiologicznym w którego rozwiązaniu może pomóc fizyka i systemy MALDI TOF są zakażenia krwi (BSI – Bloodstream infection). Są one jednym z poważniejszych problemów klinicznych z którym borykają się szpitale. Śmiertelność w przypadku zakażeń krwi waha się od 6,9 do 47% dlatego bardzo istotna jest szybka identyfikacja mikroorganizmu, którym został zainfekowany pacjent. Przy użyciu systemu MALDI Biotyper jest możliwa identyfikacja mikroorganizmy (nawet w przypadku mieszanej kultury) bezpośrednio z pozytywnych hodowli krwi. Pozwala to przyśpieszyć identyfikacje w niektórych przypadkach nawet o 24 godziny (moduł do identyfikacji mikroorganizmów w pozytywnych hodowli krwi dla systemu MALDI Biotyper firmy Bruker nazywa się „Sepsityper module” i posiada certyfikat CE-IVD).
Cały czas trwają pracę w jaki sposób wykorzystać systemy typu MALDI TOF do badania lekowrażliwości, obecnie istnieją dwie możliwości: pierwsza badanie hydrolizy wiązania betalaktamowego w wyniku działania enzymów wytarzanych przez bakterie. Druga polega na wykrywaniu markerów oporności w widmie mas otrzymanym podczas identyfikacji mikroorganizmu.
Firma Bruker jako pierwsza wprowadziła na rynek komercyjny zestaw do wykrywania aktywności enzymu β-laktamazy z certyfikatem CE-IVD w którym antybiotykiem wzorcowym jest imipenem (STAR-Carba IVD Kit (STAR – Selective Testing of Antibiotic Resistance)). Ponieważ system MALDI Biotyper jest w pełni funkcjonalnym spektrometrem mas można wykorzystać go do analizy mas niższych niż masy białek mikroorganizmów. Co oznacza, że istnieje możliwość obserwacji hydrolizy, a następnie dekarboksylacji wiązania β-laktamowego w antybiotykach, ponieważ związane jest to ze zmianą masy cząsteczkowej antybiotyku.
MALDI Biotyper firmy Bruker potrafi również wykryć niektóre markery lekooporności w bakteriach dzięki dodatkowemu modułowi (Subtyping modul). Proces ten nie wymaga dodatkowej pracy i jest przeprowadzany automatycznie po uzyskaniu wyniku identyfikacji powyżej 2.0 dla mikroorganizmów dla których możliwa jest dalsza analiza. Obecnie moduł ten pozwala na wykrywanie między innymi Klebsiella pneumoniae produkującej karbapenemaze (KPC), oporny na metycylinę szczep Staphylococcus aureus (MRSA), oporny na karbapenemy szczep Bacterioides fragilis. Moduł ten pozwala również na rozróżnienie Mycobacterium chimaera od M. intracellulare, pozwala również rozróżnić Listeria monocytogenes od innych gatunków Listeria.
Jednak powyższe możliwości to nie jedyna zaleta zastosowania „fizyki bezpośrednio” w identyfikacji mikroorganizmów. Ponieważ dzięki spektrometrowi mas analizujemy skład białkowy mikroorganizmu, a nie jego właściwości biochemiczne, MALDI TOF radzi sobie bardzo dobrze z identyfikacją drobnoustrojów wykazujących słabe właściwości biochemiczne szczególności z grupy HACEK nie potrzebujemy również podłoży różnicujących co wpływa na obniżenie kosztów w laboratorium mikrobiologicznym.
Podsumowując fizyka jest wielkim wsparciem dla współczesnej medycyny i nareszcie wkroczyła również do mikrobiologii, prezentując się w pełnej okazałości. Można mieć tylko nadzieję, że również w Polsce systemy MALDI TOF staną się standardem w analizach mikrobiologicznych, a metoda ta nadal będzie się rozwijać w tak dynamiczny sposób.
Kierownik ds. produktu MALDI Biotyper
dr Andrzej Mikołajczak