O manualnym barwieniu komórek krwi

Współczesne analizatory hematologiczne są w stanie z dużą dokładnością dokonać ilościowej i jakościowej oceny komórek krwi obwodowej. Dzięki temu w wielu przypadkach klinicznych nie ma potrzeby manualnego wykonywania rozmazów mikroskopowych.

W każdej jednak sytuacji, w której podejrzewamy występowanie jakichkolwiek patologicznych zmian w komórkach, złotym standardem jest wykonanie i ocena preparatu mikroskopowego.

Proces ten można oczywiście całkowicie zautomatyzować. Jednak ludzkie oko oraz doświadczenie oglądającego rozmaz mikroskopowy nadal jest niezastąpioną metodą.

Rys historyczny

W XIX wieku wybitny francuski lekarz, patolog, Gabriel Andral jako pierwszy zaczął badać komórki krwi przy pomocy rozmazu. Nakładał kroplę krwi na szkiełko, którą rozprowadzał przy użyciu silnego podmuchu powietrza.

W 1843 napisał  „Bardzo łatwo można zrozumieć co dzieje się gdy umieścimy kroplę krwi na szklanej płytce i silnie dmuchając rozprowadzimy cienką warstwą. Jeśli działanie przeprowadzone jest dobrze i szybko, komórki pozostają niezmienione, ich powierzchnia jest gładka a krawędzie bardzo jasne….… W tych okolicznościach odparowanie surowicy jest niemal natychmiastowe”.

 Technika rozprowadzania kropli krwi za pomocą podmuchu powietrza została zastąpiona metodą wedge smear opisaną w 1882 przez Norrisa (stosowana do dzisiaj).

Po raz pierwszy określenia „rozmaz” użył Paul Ehrlich w 1879 roku.

Ehrlich będąc jeszcze studentem wpadł na pomysł barwienia tkanek i krwi za pomocą barwinków. Próbując zrozumieć ich działanie podzielił je na kwaśne, zasadowe i neutralne. Odkrył, że różne rodzaje barwników barwią różne struktury komórki i w ten sposób dokonał, historycznego już dziś, podziału na komórki obojętnochłonne, kwasochłonne, zasadochłonne oraz komórki bezziarniste.

W kolejnych latach barwieniem komórek krwi zajmowali się Jenner oraz Dmitrij Romanowsky, który w 1891 roku opracował mieszaninę eozyny i błękitu metylenowego.

W roku 1902 Ludwig Grünwald i Richard May zastosowali, zmodyfikowaną metodę Jennera, stosując roztwór eozyny i błękitu metylenowego (metoda May-Grünwalda). Połączenie to doskonale barwiło ziarnistości leukocytów i ujawniało polichromazję erytrocytów, nie barwiło jednak jądra komórkowego. W 1904 roku Gustav Giemsa zastosował zmodyfikowany barwnik Romanowskiego poprzez dodanie do niego azuru II i roztworu glicerolu, (metoda Giemsy). Ta mieszanka barwiła jądra i ziarnistości azurochłonne.

Prawdziwym sukcesem było stworzenie barwnika uniwersalnego przez połączenie metod May-Grünwalda-Giemsy. Dokonał tego Artur Pappenheim w roku 1912 tworząc stosowaną do dzisiaj panoptyczną metodę barwienia komórek krwi.

 

Zasada barwienia

Aby zrozumieć zasadę barwienia komórek krwi należy odnieść się do specyficznych właściwości fizykochemicznych poszczególnych elementów komórkowych oraz płynów barwiących. Pojęciem ułatwiającym zrozumienie tego zagadnienia jest punkt izoelektryczny.

Każda komórka zbudowana z aminokwasów jest amfolitem. Oznacza to, że posiada grupy kwasowe i grupy zasadowe, i w zależności od pH środowiska w jakim się znajduje, może przyłączać lub odłączać protony. W środowisku kwaśnym oddaje jony OH^– (staje się kationem), a w środowisku zasadowym oddaje jony H⁺(staje się anionem). Wartość pH,  przy której liczba odłączonych jonów H⁺ jest równa liczbie odłączonych jonów OH^– czyli zawiera tyle samo ładunków dodatnich i ujemnych (całkowity ładunek zerowy) nazywamy  punktem izoelektryczny.

Zasadnicze znaczenie dla barwienia komórek krwi ma ilość jonów wodorowych zawartych w roztworze barwiącym. Sam alkoholowy roztwór barwnika jest nieaktywny. Dopiero dodanie buforu powoduje uzyskanie ładunków jonowych przez cząsteczki barwnika i selektywne wybarwienie poszczególnych składników komórkowych. Jeżeli do barwienia używamy wody należy zadbać o jej właściwe pH. Powinno się ono zawierać w granicach 6,8-7,2 (optymalne 7,03). Najlepsza będzie woda destylowana.

W roztworze o pH zasadowym, komórka otrzymuje ujemny ładunek elektryczny i chłonie dodatnio naładowane barwinki zasadowe- zasadochłonność komórki. Jeśli pH barwnika przesuwa się w kierunku kwaśnym, komórka otrzymuje dodatni ładunek elektryczny i chłonie ujemnie naładowane barwniki kwaśne-kwasochłonność komórki.

Na przykład, gdy roztwór barwnika jest zbyt alkaiczny to barwienie odbywa się powyżej punktu izoelektrycznego dla erytrocytów i zabarwiają się one na niebiesko.

 

Barwniki hematologiczne

Odczynniki stosowane do barwienia preparatów hematologicznych, dzielą się na kwaśne i zasadowe. Najczęściej stosowanym barwnikiem kwaśnym jest eozyna. Zabarwia zasadowe składniki komórki na kolor czerwony, np. hemoglobinę w erytrocytach lub ziarnistości eozynofilów. Barwnikami zasadowym są błękit metylenowy i azur II.

Błękit metylenowy zabarwia kwaśne składniki komórki np. RNA i DNA na kolor niebieski. Azur II jest połączeniem azuru I i błękitu metylenowego. Zabarwia na różne odcienie fioletu (od granatowego do prawie czerwonego) ziarnistość azurochłonną wczesną występująca w prekursorach granulocytów i monocytów, ziarnistość azurochłonną  limfocytów i płytek krwi oraz chromatynę jądrową pasożytów krwi, (np. zarodźca malarii).

Swoiste ziarnistości obojętnochłonne w neutrofilach barwią się jednocześnie barwnikami kwaśnymi i zasadowymi.

W Polsce najczęściej stosuje się barwienie metodą Pappenheima czyli May-Grünwalda-Giemsy (MGG). Utrwalaczem w tej metodzie jest alkohol metylowy.

W Stanach Zjednoczonych najbardziej popularne jest barwienie jednoskładnikowym barwnikiem Wrighta.

 

Interpretacja prawidłowo wybarwionego rozmazu

Komórka/element komórki		Kolor barwienia
Erytrocyty		Łososiowe, różowołososiowe
Chromatyna jądrowa (RNA, DNA)		Fioletowa, ciemnofioletowa
Neutrofile	Chromatyna	Ciemnofioletowa
	Cytoplazma	Jasnoróżowa
	Ziarnistości pierwotne Ziarnistości wtórne	Ciemnogranatowe Liliowe
Eozynofile	Chromatyna	Ciemnofioletowa
	Cytoplazma	Bladoniebieska
	Ziarnistości	Koralowe, ceglaste
Bazofile	Chromatyna	Ciemnofioletowa
	Ziarnistości	Niebieskoczarne
Monocyty	Chromatyna	Niebieska
	Cytoplazma	Szaroniebieska
Limfocyty	Chromatyna	Ciemnofioletowa
	Cytoplazma	Błękitna
Płytki krwi	Hialomer	Niebieski
	Granulomer	Czerwony

 

Aby uzyskać prawidłowo zabarwiony rozmaz, należy go najpierw bardzo dobrze wysuszyć. Najlepiej odczekać co najmniej godzinę od momentu wykonania rozmazu.

Barwienie preparatu słabo wysuszonego powoduje zmiany kształtu erytrocytów co może skutkować niewłaściwą oceną komórek.

Czas barwienia zależy przede wszystkim od komórkowości preparatów oraz od stężenia odczynników barwiących. Każde laboratorium powinno dostosować procedurę barwienia do swoich potrzeb.

Monika Błocka-Gumowska