„Nadchodzi genomika spersonalizowana… czyli jak przejść od teorii do praktyki, przy pomocy spektrometrii mas dedykowanej analizie kwasów nukleinowych”

W dzisiejszych czasach obserwujemy pojawianie się coraz to nowszych metod w dyscyplinach związanych z biologią molekularną. Są to techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych (DNA, RNA, cpDNA), które umożliwiają lepsze poznawanie podłoża molekularnego procesów fizjologicznych oraz chorób człowieka, zwierząt i roślin. Prowadzenie takiej pracy nieustannie rodzi potrzebę zachowania rzetelności  i wiarygodności  otrzymywanych wyników. Badania w zakresie szeroko pojętej genomiki spersonalizowanej inicjują szereg działań zmierzających do opracowania  metod  jeszcze skuteczniejszej diagnostyki, profilaktyki  i terapii chorób cywilizacyjnych m.in. poprzez poznawanie coraz to nowszych biomarkerów oraz sprawniejszą i precyzyjniejszą identyfikację patogenów. Wzrastające znaczenie badań genetycznych w nauce, diagnostyce, agrotechnice i terapii pacjenta, nieustannie generuje zapotrzebowanie na perfekcyjny sprzęt laboratoryjny oraz rzetelną wiedzę wynikającą z bogatych doświadczeń osób, które przez wiele lat zajmowały się danym tematem. Firma KAWA.SKA Sp. z o.o. stara się gromadzić na organizowanych przez nas warsztatach, seminariach i wykładach ludzi legitymujących się takim właśnie doświadczeniem, a do tego chętnych aby się tą wiedzą dzielić.

Bardzo rzadko zdarza się, że laboratoria znajdują się w pomieszczeniach od samego początku projektowanych z takim przeznaczeniem. Jako firma sprzedająca zaawansowane systemy laboratoryjne często służymy radą w temacie organizacji nowej lub już istniejącej przestrzeni laboratoryjnej. Poza proponowanymi normami i wytycznymi dotyczącymi funkcjonowania laboratoriów biotechnologiczno – diagnostycznych (dotyczą one głównie personelu), nie ma jasnych przepisów na optymalne urządzenie laboratoriów do analiz genetycznych. Ilość i jakość sprzętu, który znajdzie się w planowanym laboratorium zależy od środków, którymi dysponuje Zamawiający i od rodzaju technik, które będzie stosował. Jednakże stan jego wiedzy na temat organizacji pracy zwykle ma wpływ na uzyskiwane później wyniki (nawet jeżeli używa do tego celu systemów z tzw. „najwyższej półki”).  Widząc pod mikroskopem, przy pomocy zaawansowanych technik obrazowania, rzeczy na co dzień „niewidzialne” np. struktury  komórkowe, aż się prosi aby zobaczyć jeszcze więcej, wniknąć w głąb tych struktur, poznać ich skład, odczytać genom konkretnej komórki.

Istnienie mutacji i polimorfizmów o znaczeniu prognostycznym i predykcyjnym sprawiło, że analiza genomu staje się niezbędnym narzędziem we współczesnej diagnostyce. Niestety, stosowane obecnie na szeroką skalę klasyczne techniki analityczne wykazują wiele ograniczeń i niedoskonałości — są czasochłonne i mało wydajne, a przy tym nie pozwalają na uzyskanie pełnej informacji o badanym przypadku. Postępujący rozwój technologii przyczynił się do opracowania wielu nowych, wysoce zaawansowanych rozwiązań, takich jak techniki oparte na zastosowaniu mikromacierzy, ilościowych analiz ekspresji genów, nowoczesnych technik sekwencjonowania czy też wykorzystanie spektrometrii mas do analizy kwasów nukleinowych. Rozwiązania te umożliwiają dokładniejszą i bardziej wydajną analizę materiału genetycznego.

Wszystkie osoby zajmujące się proteomiką doskonale znają technikę MALDI TOF. Nie każdy jednak wie, że zastosowanie tej technologii do analizy kwasów nukleinowych ze zgromadzonego materiału tkankowego lub krwi obwodowej umożliwia niezwykła czułość systemu MassARRAY, zdolnego rozdzielać wszystkie podstawowe cztery składowe DNA. Są to zasady azotowe: adenina; tymina; guanina i cytozyna. Przy założeniu, że nie ulegną żadnej mutacji wszystkie one posiadają stałą  i niezmienną masę wyrażoną w Daltonach. Każda potencjalna zmiana np. substytucja wpływa na masę analizowanego fragmentu DNA. Pozwala to na uzyskanie największej możliwej czułości detekcji wykrywanych zmian w genomie (dużo poniżej 1% występowania w badanej populacji) oraz powtarzalność pomiarów równą precyzji „molekularnej wagi” jaką jest system MassARRAY® Analyzer (AGENA Bioscience, USA). Ten spektrometr mas działa, jak mawia jeden z jego twórców dr Charles Cantor, niczym „elektroforeza w próżni”. Jest to wysokowydajna technologia, która opiera się na wykorzystaniu unikalnego spektrometru mas MassARRAY® Analyzer. System ten w wersji 96 lub 384 dołkowej jest wysokiej jakości platformą do analizy DNA i RNA, pozwalający na skuteczne i precyzyjne pomiary ilości materiału genetycznego i jego zmienności. System MassARRAY (dostępny także w wersji z certyfikacją CE-IVD) dostarcza jednocześnie specyficznych i czułych wyników bazując na połączeniu spektrometru masowego z mocnymi podstawami biologii molekularnej oraz zaawansowanego oprogramowania do analizy danych.

Podstawą w opisanej metodyce badań jest desorpcja laserowa matrycy z którą związane jest badane DNA  techniką MALDI (Matrix – Assisted Laser Desorption / Ionization). Jonizacja laserowa zachodzi z tak dobraną energią wiązki, aby nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek lecz tylko do ich wybijania. Dodatkowo wszystkie „składowe cząstki DNA” posiadają po jonizacji ten sam ładunek i różnią się pomiędzy sobą jedynie masą. Następnie działa analizator czasu przelotu – TOF (Time of Flight Analyser) – cząsteczki wprowadzane do analizatora są przyspieszane przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają dryfować przez komorę analizatora. Na końcu analizatora znajduje się detektor jonów połączony z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonej cząsteczki w detektor. Pomiar stosunku masa-ładunek jest oparty na fakcie, że dla impulsu o danym natężeniu czas przelotu jonów wydłuża się ze wzrostem ich masy cząsteczkowej.

Wstępnym etapem procesu przygotowania próby do tego rodzaju badań jest w tym przypadku amplifikacja wyizolowanego wcześniej materiału genetycznego za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR, polymerase chain reaction). Tym samym namnażamy najbardziej interesujące nas pod względem założonych hipotez fragmenty DNA. Następnie przy wykorzystaniu fosfatazy alkalicznej (SAP) usuwany jest nadmiar deoksynukleotydów, które mogą zaburzać odczyt końcowych wyników. Główny etap stanowi tak zwana reakcja iPLEX® — startery przygotowane dla badanej próbki podlegają wydłużaniu z wykorzystaniem dideoksynukleotydów terminalnych odpowiednio zmodyfikowanych pod względem masy cząsteczkowej. Po przeprowadzeniu multipleksowych reakcji (w jednym dołku reakcyjnym może dochodzić do amplifikacji nawet 36 różnych produktów), uzyskany materiał poddawany jest  przebiegającej równolegle analizie statystycznej. Wykryte różnice w uzyskanych widmach masowych pozwalają na ujawnienie istniejących polimorfizmów lub mutacji. Wszystkie etapy procesu wykonywane są automatycznie w zaprojektowanym do tego urządzeniu.

W ostatnich latach duże nadzieje wiąże się z badaniem zjawiska wrodzonej podatności na zmiany homeostazy organizmu, wynikającej z występowania odpowiednich mutacji lub polimorfizmów (SNP – polimorfizmów pojedyńczych nukleotydów). Zastosowanie proponowanej technologii pozwoli nie tylko na stwierdzenie występowania niemożliwych wcześniej do wykrycia zmian genetycznych, ale również na prowadzenie badań w nowych obszarach, takich jak analiza czynników epigenetycznych na aktywność poszczególnych regionów genomu. Analiza jednonukleotydowych polimorfizmów ma duże znaczenie w kontekście indywidualnych predyspozycji chorych do zapadalności na różnorodne choroby i może mieć zastosowanie w analizie zmian kodu genetycznego w postępującym procesie starzenia. Wykorzystanie technologii spektrometrii mas dedykowanej do analizy kwasów nukleinowych umożliwi prowadzenie wydajnych badań asocjacyjnych, ujawniających korelacje między wystąpieniem konkretnych mutacji lub polimorfizmów, a pojawieniem się określonej formy zmiany w procesie starzenia się organizmu. W procesie leczenia monitoring biomarkerów genetycznych można wykorzystać do obserwacji odpowiedzi tkanek lub narządów na podawane substancje czynne. Zestawy wysoce informatywnych polimorfizmów skorelowane mogą być z procesem wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu czy wydzielania leków. Na tej podstawie powstają panele do badań farmakogenomicznych.

Opisana w tym artykule  metodyka nie tylko pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie SNP i profilowanie mutacji przy użyciu oprogramowania Typer, co umożliwia znaczne obniżenie kosztów analiz. Siłą MassARRAY jest nadążanie za rozwojem studiów nad całym genomem, w sposób bardziej uporządkowany i celowy, w zależności od założonych hipotez badawczych. W dalszej perspektywie użytkownicy mogą łatwo rozbudować urządzenie o oprogramowanie do ilościowej analizy metylacji wysp cytozynowych CpG (EpiTyper). System pozwala na uzyskanie rzetelnych i swoistych danych ze złożonych próbek biologicznych oraz z materiału genetycznego dostępnego nawet w śladowych ilościach.

dr Piotr Grochowski

KAWA.SKA Sp. z o.o.

One Comment

Dodaj komentarz