Precyzyjne i pozbawione błędów pipetowanie jest niezbędnym elementem procesu diagnostycznego. Skala obciążeń, którymi obarczamy wynik końcowy pipetując źle, lub przy użyciu uszkodzonego urządzenia, zależy od wykonywanej metody – nie oznacza to jednak, że pracując technikami mniej wrażliwymi możemy nie przejmować się „drobnymi” odchyleniami i traktować nasze narzędzie jako zakraplacz.
Nie chcę przypominać elementarza, nie będę wspominał o oporach, pozycji, zależności gęstość – temperatura i innych podstawowych sprawach; zakładam, że bez względu na studia, które kończyliśmy absolwent miał szansę nacisnąć przycisk tłoczka przynajmniej kilka tysięcy razy. Nie będę także zagłębiał się w niuanse, które mogłyby robić różnice przy badaniach, w których pipetowanie jest nadrzędnym etapem preparatyki.
Najpopularniejszą pipetą używaną w laboratoriach klinicznych jest pipeta pneumatyczna z przestrzenią powietrzną (Air Displacement Pipette). Działa na zasadzie podobnej do strzykawki, z tą różnicą, że przerwa powietrzna uniemożliwia kontakt tłoczka z pipetowanym roztworem. Czy zawsze uniemożliwia? Skoro pytanie zostało zadane – odpowiedź musi brzmieć „nie”. Kilka przykładów:
– roztwory łatwo parujące – skraplające się na tłoku i w cylindrze tłoka
– położenie pipety horyzontalnie na stole z tipem wypełnionym pipetowanym roztworem
– roztwory niejednorodne, zawierające elementy mogące zablokować napełnienie tipa, po powtórnej próbie podciśnienie usuwa przeszkodę a pipeta skokowo nabiera zbyt dużą ilość roztworu.
– pozostawianie użytego tipa na pipecie – zarówno w pozycji wertykalnej jak i horyzontalnej, nie- ważne, że to tip „do wody”, woda też paruje i dostaje się do cylindra zmieniając właściwości narzędzia, a po pewnym czasie ma szanse spowodować korozję.
Wszystkie powyższe sytuacje zdarzają się na co dzień. Najgorszym pomysłem jest je zauważać a następnie ignorować, zwłaszcza, że prosta akcja ratunkowa, polegająca na przemyciu wnętrza, zazwyczaj ratuje pipetę przed śmietnikiem lub naprawą. Jak to zrobić? Używamy 70% etanolu, lub mieszaniny etanol-chloroform (więcej w źródłach). Nie zważając na opory pipety nabieramy do tipa „zbyt dużo” roztworu etanolu i powoli odwracamy. Czynność powtarzamy kilkakrotnie, następnie zrzucamy roztwór czyszczący i pozostawiamy pipetę w pozycji wertykalnej do wysuszenia.
Dla podkreślenia częstości występowania wymienionych zjawisk przywołam historię z własnego doświadczenia, otóż kilka lat temu, sam zaciekle broniłem tipa „do octanu uranylu” – bo dobrze pasował do pipety, więc zapragnąłem aby pozostały nierozdzielne jak najdłużej. No właśnie… jeśli kupujemy tipy, z których jeden pasuje „lepiej” a inny „gorzej” skazujemy się na brak powtarzalności w oznaczeniach. Dlatego zapewniam, że oszczędności lepiej poszukać gdzie indziej.
Kilka słów o technice (miało nie być o sprawach podstawowych, ale o tym muszę). Otóż technika pipetowania zależy od techniki laboratoryjnej, w której jest używana. Czasem trzeba cos dostarczyć na dno probówki zanurzając całego tipa, ale jeśli taka procedura nie jest wymagana – pamiętajmy o tym, że nabierając 10 μl lepkiej substancji możemy nawet podwoić tą ilość pozostałościami na ścianach tipa. Wycieranie może okazać się zgubne, gdyż muśnięcie ligniną końcówki tipa (końcówka tipa to klasyczny pleonazm, ale wiemy o co chodzi) spowoduje utratę części już raz odmierzonej zawartości. Warto więc ćwiczyć takie pipetowanie, aby żadne późniejsze wycieranie nie było potrzebne.
Jak sprawdzić, czy pipeta działa? To bardzo łatwe i bardzo trudne zarazem. Łatwe dlatego, że w przypadku wody dość łatwo przeliczyć jej objętość na masę. Możemy więc zważyć ilość, którą odmierzamy. Wykonujemy serię (np. 20 razy). Jeśli wariancja nie przekracza +/- 1% to pipeta i pipetujący działają. Dlatego ten sposób walidacji pipety bywa trudny. Jest wyjątkowo czuły na błędy osoby pipetującej – tak samo, zresztą, jak wyniki oznaczeń.
Na podstawie:
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/index.html
http://www.gilson.com/Resources/Gilson%20Guide%20To%20Pipetting%20Third%20Edition.pdf
Maciej Smutek