Diagnostyka onkologiczna w ostatnich latach przeszła i nadal znacząco przechodzi radykalną zmianę w metodach stosowanych w rutynowej ocenie. Wiąże się to z wprowadzeniem molekularnych biomarkerów w służbę diagnostyce. Dzięki dynamicznemu rozwojowi genetyki, rośnie poziom wiedzy o biologii nowotworów. Odkrywane są specyficzne zaburzenia genetyczne będące przyczyną poszczególnych nowotworów. Biomarkery molekularne stanowią nowoczesne metody diagnostyczne, w oparciu o zmiany wykrywane w DNA, RNA, mikroRNA (miRNA) oraz białkach. Znacząca część tej wiedzy powstałą ze zrozumienia zmian zachodzących w komórkach nowotworowych na poziomie molekularnym. Podczas patogenezy i rozwoju nowotworu, komórki rakowe przechodzą zmiany w wielu cząsteczkach komórkowych, w tym w całym aparacie genetycznym.
Zmiany molekularne, o których mowa, są deregulowane poprzez specyficzne i nieodłączne właściwości biologiczne komórek nowotworowych w trakcie ich rozwoju oraz nabywania zdolności metastatycznych i inwazyjnych. Te modyfikacje mają różną postać nie tylko ze względu na pochodzenie komórek nowotworu ale także są zależne od stopnia dyferencjacji i stopnia inwazyjności komórek. Oczywiście grają one bardzo ważną i właściwie główną rolę w rozwoju guza czy ogólnej przeżywalności komórek nowotworowych. I jako takie, stanowią idealny cel dla diagnostyki i rozwoju nowych terapii celowanych raka. Kompleksowe podejście oparte na detekcji zestawu zmian molekularnych daje nam rozpoznawalny wzór, charakterystyczny dla odrębnych rodzajów nowotworu; jak tylko rozpoznamy swoisty „podpis molekularny”, właściwy dla nowotworu, może on służyć za podstawę do opracowania celowanej terapii onkogenetycznej.
Wyróżnia się trzy podstawowe poziomy zmian molekularnych. Występujące na poziomie DNA mogą być scharakteryzowane jako niewłaściwa replikacja genów, translokacje, mutacje punktowe, delecje lub insercje. Na poziomie RNA najczęstsze zmiany występują w błędnej transkrypcji oraz niewłaściwych modyfikacjach potranskrypcyjnych. Oczywiście jako trzecia grupa zostają nam jeszcze zmiany na poziomie translacji i procesów potranslacyjnych białek. W oparciu o klasyfikację hematologicznych nowotworów złośliwych przez WHO, zmiany genomiczne są nieodzowną częścią diagnostyki raka, co ma szczególne implikacje w wyborze poprawnej terapii. Także prognoza oraz ocena ryzyka powinna być oparta o te kryteria
Podstawową diagnostykę onkologiczną można już przeprowadzić za pomocą zwykłej reakcji łańcuchowej polimerazy, po której nie uzyskujemy wyniku bezpośrednio, lecz trzeba produkt amplifikacji rozdzielić i zwizualizować na żelu agarozowym z dodatkiem barwnika, który przyłączony do kwasu nukleinowego pozwoli na detekcję jego obecności pod światłem UV. Warto jednak zauważyć, że taka elektroforeza ma swoje ograniczenia, takie jak niska rozdzielczość oraz precyzja rozdziału.
Dodatkowo, nie pozwala na dokładną ocenę ilości kopii amplikonu. Dlatego też do diagnostyki wprowadzono (prócz real-time PCR oczywiście, ale o tym poniżej), metody elektroforezy kapilarnej. Jest ona użyteczna w takich badaniach jak detekcja translokacji różnych sekwencji w badanym genie, zmiany na poziomie pojedynczych nukleotydów (SNP) oraz utratę heterozygotyczności (LOH). Razem z dostępem do metod sekwencjonowania badanych próbek, stanowi to bardzo dokładną i szybką metodę diagnostyczną.
Istnieją inne nowoczesne, wysokoprzepustowe metody molekularne w diagnostyce onkologicznej. Wśród nich można wyróżnić biosensory elektrochemiczne, SAT (metoda mikrokulek w zawiesinie), macierze mikropłynowe oraz jednoetapowy RT-PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR). Ponadto cytometria przepływowa oraz genomika molekularna są ważną częścią diagnostyki nowotworów hematologicznych. Jednym z obiektów badań są mikroRNA (miRNA). Z racji faktu, że poziomy ekspresji miRNA są specyficzne dla danego nowotworu, badania miRNA w diagnostyce zyskują na popularności. Klasyczne przykłady miRNA z potencjałem onkogenicznym to miR-155, miR-17-92 oraz miR-21, którego nadekspresja charakteryzuje wiele nowotworów. Największą zaletą użycia miRNA w diagnostyce onkologicznej jest fakt, iż posiadają one zdolność do równoczesnego ingerowania w różne ścieżki metaboliczne, związane z różnicowaniem komórek, proliferacją oraz przeżyciem komórek nowotworowych.
Ale diagnostyka molekularna to nie tylko miRNA.
Dla przykładu w stratyfikacji terapeutycznej ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), szczególnie w pediatrii, wykorzystuje się ilościowy PCR z rozróżnieniem alleli genu (IG/TCR-QPCR), który cechuje się wysoką powtarzalnością oraz czułością na poziomie wykrywalności przynajmniej 0.01% w detekcji choroby szczątkowej (MRD). Oczywiście ta metoda może zostać zastosowana także przy badaniu dorosłych. Inną przydatną metodą w molekularnym monitorowaniu przebiegu białaczki jest RT-PCR z wykorzystaniem multipleksu (oznaczania różnych sekwencji w jednym czasie, w jednej próbce), często połączony z detekcją przepływową. Te metody bardzo łatwo dają się zastosować w laboratorium klinicznym i razem ze standardowymi metodami cytogenetycznymi stanowią o pełnym obrazie diagnostycznym pacjenta.
RT-PCR w czasie rzeczywistym jest także wykorzystywany w detekcji i oznaczeniu ilościowym (metodą relatywną) transkryptów genów fuzyjnych ABL1 z próbek klinicznych (krew, szpik) w opracowywaniu nowej diagnozy oraz monitorowaniu remisji. Ponadto można tą metodą wykryć mutacje w domenie kinazy ABL1 nabyte przez pacjenta; najpierw wykonuje się RT-PCR specyficzny dla translokacji w genie ABL1, po którym przeprowadza się następny PCR, który jest specyficzny dla domeny kinazy. Po całym procesie identyfikuje się mutacje odpowiedzialne za lekooporność metodą dwukierunkowego sekwencjonowania produktu PCR. Podobnie działa ta metoda w identyfikacji mutacji w obrębie genu KRAS, użyta do przewidywania odpowiedzi pacjenta na celowane terapie.
Oprócz powyższego, typowymi zastosowaniami paneli genetycznych oraz genomowych są oznaczenia złożone z detekcji mutacji w obrębie genów BRAF, KIT, NRAS, GNA11 and GNAQ dla czerniaka oraz ALK, EGFR, KRAS and BRAF dla nowotworów płuc; dla ostrej białaczki szpikowej taki panel składa się z detekcji FLT3ITD/FLT3-TKD, NPM1, C-KIT, PTPN11 oraz CEBPA. Ponadto ilościowy PCR ma o wiele większe zastosowanie w diagnostyce onkologicznej, w detekcji zmian w obrębie DNA/RNA/miRNA. Może być użyty jako doskonałe narzędzie do detekcji polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP), profilowania ekspresji genów oraz ilościowego oznaczana wiremii w zakażeniach skorelowanych z nowotworzeniem. Wszystkie te oznaczenia pomocne są nie tylko w diagnozie początkowej, ale także mają zastosowanie w badaniu remisji, w badaniach kontrolnych pacjenta po leczeniu lub też w ocenie skuteczności zastosowanej terapii
Istnieją także inne biomarkery oraz inne metody molekularnej przydatne w diagnostyce onkologicznej. Niektóre z nich mogą być ponadto celem dla zastosowanych leków (np. przy użyciu inhibitorów niskocząsteczkowych). W tej grupie znajdują się między innymi markery hematologicznych nowotworów złośliwych, takie jak FLT3, NPM1, CEBPA oraz PRAM1 w przebiegu ostrej białaczki szpikowej. Zmiany w obrębie genu BCR-ABL służą jako doskonały marker w przebiegu zespołów mieloproliferacyjnych, jak przewlekła białaczka szpikowa a zmiany w JAK2 w czerwienicy prawdziwej, pierwotnym zwłóknieniu szpiku oraz samoistnej nadpłytkowości. Dodatkowo, mikrośrodowisko nowotworu, jak np. komórki odpornościowe mogą służyć jako doskonały biomarker, jako że zmieniają zachowanie nowotworu. Do innych metod wykorzystywanych w tych oznaczeniach należą ilościowy PCR-ARMS (allelospecyficzny PCR np. w detekcji kluczowej dla PV mutacji JAK2) oraz RFLP (badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych), nested PCR (zagnieżdżony PCR), FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja DNA w tkance), elektroforeza kapilarna, (piro)sekencjonowanie, analiza sekwenomu (genotypowanie polimorfizmu), sekwencjonowanie celowanych paneli genów oraz mikromacierze. Wyróżnia się także zastosowanie spektrometrii masowej typu MALDI-TOF w oznaczeniach polimorfizmu, SNP i zmianach allelicznych w DNA.
Krótko o wykorzystaniu metod molekularnych w terapii celowanej.
Metody molekularne pozwalają nie tylko na szybkie zdiagnozowanie typu nowotworu, ale poprzez informację, w którym genie następuje mutacja, znajdują zastosowanie w celowanej terapii. Typowym przykładem może tutaj być BCR-ABL, który jest celem dla terapii Imatynibem oraz Dasatynibem. W czerniakach, mutacje BRAF są celem dla Vemurafenibu. Tak samo mutacje EGFR są celowane Gefitynibem oraz Erlotynibem. Cetuximab i Panitumumab z kolei działają na KRAS w raku jelita. Ponadto, niektóre badania sugerują, że podawanie aspiryny poprawia odpowiedź pacjenta na leczenie w raku jelita, szczególnie u pacjentów ze zmutowanym genem PIK3CA, sugerując ten gen jako potencjalny marker molekularny. Tak samo druga główna zmiana w ścieżce genomicznej w rozwoju raka jelita jest wywołana przez niestabilność mikrosatelitów (MSI), spowodowaną przez mutację w MMR, co z kolei stanowi bardzo obiecujący marker molekularny dla chemiowrażliwości. Istnieją również inne przykłady wykorzystania markerów molekularnych w terapiach celowanych a ich przydatność jest coraz bardziej dokładnie badana.
Słowo o mikrobiologii.
Nowoczesne metody molekularne stosowane są także w oznaczeniach ludzkich patogenów. Dostępne są testy wykonywane za pomocą reakcji PCR lub jej odmian, większość z nich charakteryzuje się szybkim czasem diagnozy oraz wysoką czułością. Ten temat chciałbym poruszyć w szerszym kontekście w innym artykule, jednak dwie informacje są istotne dla diagnostyki onkologicznej, tak więc zostaną tutaj zasygnalizowane. Po pierwsze, uważa się, że niektóre z wirusów przyczyniają się do rozwoju specyficznych nowotworów. Przykładem tutaj może być HPV – wirus brodawczaka ludzkiego, który, występując w tkankach nowotworowych głowy czy karku może stanowi implikacje prognostyczne, a występując w narządach płciowych jest odpowiedzialny za występowanie raka szyjki macicy. Ponieważ dowiedziono, że nie wszystkie genotypy wirusa HPV są równie groźnie, niezmiernie ważna jest możliwość rozróżnienia, który genotyp znajduje się w organizmie pacjenta. Na rynku dostępne są testy molekularne, które potrafią rozróżnić większość najczęściej występujących genotypów, łącznie z podziałem ich na te wysokiego i niskiego ryzyka onkologicznego. Drugą sprawą są zakażenia szpitalne u osób z immunosupresją, które niegroźne dla zdrowego człowieka, mogą bardzo utrudnić, lub nawet uniemożliwić rekonwalescencję pacjenta po terapii immunosupresyjnej lub po ciężkich operacjach i przeszczepach. Do takich wirusów zazwyczaj zalicza się CMV, EBV, HPV, HCV, HIV i HBV. Ich poziom wiremii powinien być kontrolowany na bieżąco, w czym wybitnie pomaga diagnostyka molekularna, na przykład metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, wykonywana w regularnych odstępach czasu.
dr Rafał Czyżyk