Faza przedanalityczna bardzo często uważana jest za najłatwiejszą część procesu diagnostycznego. Nic bardziej mylnego. Błędy popełniane w czasie jej trwania w wyraźny sposób rzutują na wyniki późniejszych pomiarów. Jednym z aspektów przygotowania materiału jest jego zabezpieczenie i konserwacja do analiz, które z przyczyn niezależnych, muszą być wykonane w terminie późniejszym. Nierzadko w innym laboratorium. Chłodzenie i zamrażanie to rozwiązania rutynowo stosowane przy przechowywaniu materiału do badań i transportu, bardzo często zalecane przez firmy zapewniające osprzęt do oznaczeń. Musimy jednak pamiętać o ograniczeniach tych metod, wynikających z właściwości substancji biologicznych, aby nie wpaść w pułapkę wynikającą z niewłaściwego przygotowania materiału do badań.
Podczas zamrażania i rozmrażania materiału kluczowe są właściwości samej wody. Otóż, diwodorek tlenu zamarza na kilka sposobów w zależności od okoliczności. Najczęściej tworzy kryształy, mogą one być sześcienne (kubiczne) lub oparte na heksagonie. Dzieje się tak, gdy zamarzanie następuje powoli a kolejne cząsteczki wody „dobudowują” się do już wykształconych struktur. Jednak woda może zamarznąć także w sposób amorficzny, bez wytworzenia struktury krystalicznej. Możliwe jest to przy nagłym usunięciu energii cieplnej z wykorzystaniem bardzo dużej różnicy temperatur. Powstała nawet technika krioprezerwacji oparta na takiej metodzie. Wykonanie jest banalne, wystarczy upuścić próbkę do pojemnika z ciekłym azotem, by następnie przenieść ją do zamrażarki -80°C.
Technikę nazwano „snap-freezing” i jest często używana w biobankach na całej planecie. Jak każda nowość, zdobyła wielu sympatyków i równie wielu przeciwników. Naukowcy wzięli technikę pod lupę i, posiłkując się oznaczeniami znanych markerów, starają się ocenić jej przydatność i porównać z powolnym zamrażaniem. Owocem są liczne artykuły, pozornie pełne sprzecznych informacji, gdyż jeden autor donosi, że snap-freezing zapobiega denaturacji pewnych markerów białkowych, a inny autor sugeruje, że takie zamrażanie powoduje denaturację a prewencją jej zaistnienia jest powolne zamrażanie i szybkie rozmrażanie materiału. Oczywiście obaj mogą mieć rację, gdyż każdy z nich pracował na innym białku. W codziennej praktyce często obserwujemy podobne sytuacje: jeśli zamrozimy zrekonstytuowaną multikontrolę biochemiczną zmniejszymy w niej aktywność LDH, jeśli przetrzymamy ją w lodówce to LDH pozostanie nietknięte, zaobserwujemy za to, wraz z upływem czasu, spadek stężenia bilirubiny i aktywności ALP. Właśnie dlatego technika prezerwacyjna powinna być dostosowana do parametru, który ma być zmierzony w późniejszym czasie, lub przynajmniej wzięta pod uwagę podczas późniejszych oznaczeń parametru „niezaplanowanego”.
Z punktu widzenia opartego na użytym materiale surowica najlepiej „znosi” mrożenie, choć można mrozić także osocze z EDTA lub cytrynianem sodu. Nawet krew pełna może być prezerwowana w ten sposób do niektórych badań. DNA do oznaczeń molekularnych jest na tyle stabilne, że jego precypitacja z zupy pouszkadzanych krwinek nie stanowi problemu.
Wszyscy autorzy artykułów zgodnie podtrzymują tezę, iż materiał traci przydatność wraz z kolejnymi zamrożeniami i rozmrożeniami. Dlatego dobrze jest trzymać się złotej zasady, by nie zamrażać ponownie raz rozmrożonego materiału. Inną ciekawostką, której prawdziwość potwierdza wielu autorów, jest fakt, że mniejsze ilości próbki lepiej i dłużej zachowują swoje właściwości niezależnie od rodzaju materiału czy parametru. Ponadto w pracach rzadko obserwowano wpływ przechowywania w stanie zamrożenia na takie parametry jak AST, ALT, GGTP, cholesterol, glukoza, kreatynina, bilirubina bezpośrednia czy HDL, nie zanotowano statystycznych różnic przy oznaczeniach nawet po kilkunastu miesiącach w stanie zamrożenia. Dodatkowo AST i ALT zachowywały aktywność po kilkukrotnym zamrożeniu tego samego materiału.
Różnice statystyczne, ale nie kliniczne, zauważone zostały dla kinazy keratynowej oraz kwasu moczowego (spadek). Znaczące różnice występowały w oznaczeniach azotu mocznika (wzrost) a największymi odchyleniami odznaczały się: LDH (ze znacznym spadkiem aktywności) oraz białko całkowite i albumina, których stężenia po długim przechowywaniu w zamrażarce rosły. Dla kontrastu, fibrynogen w mrożonym osoczu cytrynianowym zachowywał się bardzo stabilnie, nawet po kilkunastomiesięcznym czasie przechowywania (aPTT, z kolei, wydłuża się znacząco wraz z czasem krioprezerwacji).
Osmolalność przechowywanych próbek rośnie o kilka procent, co całkowicie wyklucza ten parametr z oznaczenia z próbek rozmrożonych. Nie powinno się także oznaczać osmolalności w próbkach, które były przechowywane w lodówce, wyniki będą z początku zaniżone przez związanie elektrolitów z białkami a po pewnym czasie zawyżone, gdyż białka oddysocjują jony do roztworu (właśnie z tego powodu wyniki są zawyżone po rozmrożeniu). Nie ma reguły jeśli chodzi o oznaczenie hormonów i większych cząsteczek. Co prawda, większość rutynowo oznaczanych (poza ACTH) można przechowywać latami, niektóre jednak, zwłaszcza te o największych cząsteczkach mogą ulec uszkodzeniu (nawet zniszczeniu struktury łańcucha polipeptydowego). Krioprezerwacja może także prowadzić do zmiany budowy miejsca wiązania swoistego przeciwciała w oznaczeniach opartych na technice immunoassay. Zawsze warto sprawdzić czy dany parametr może być oznaczony z prezerwowanej próbki, nawet jeśli wiąże się to z większym wysiłkiem niż przejrzenie ulotki odczynnikowej.
Na koniec: pamiętajmy o dwóch ważnych sprawach..
1) Opisanie sposobu przygotowania próbki ułatwia późniejsze oznaczenia.
2) Spora część bakterii przeżywa mrożenie w -20°C.
Na podstawie:
Advances in Biopreservation pod redakcją J. G. Baust i J. M. Baust
The effect of storage time and freeze-thaw cycles on the stability of serum samples [S. Cuhadar, M. Koseoglu, A. Atay, A. Dirican]
Pitfalls in the Measurement of Plasma Osmolality Pertinent to Research in Vasopresin and Water Metabolism [N. Bohnen, D. Terwel, M. Markerink, J. A. Ten Haaf, J. Jolles]
Effects of freezing method and storage at -20°C and -70°C on prothrombin time, aPTT and plasma fibrinogen levels [S. Alecsi, M. Borggrefe, C. E. Dempfle]
Standard Operating Procedure for Serum and Plasma Collection: Early Detection Research Network Consensus Statement Standard Operating Procedure Integration Working Group [M. K. Tuck, D. W. Chan, D. Chia, A. K. Godwin, W. E. Grizzle, K. K. Krueger, W. Rom, M. Sanda, L. Sorbara, S. Stass, W. Wang, D. E. Brenner]
Maciej Smutek
COZL